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¿Qué es la cromatografía en columna (CC)?
La cromatografía en columna (CC) es un método de purificación y separación preparativa. La columna se rellena con un adsorbente (fase estacionaria), generalmente gel de sílice o alúmina. La muestra se introduce en la parte superior y un disolvente o mezcla de disolventes (eluyente) arrastra los componentes a distinta velocidad en función de su interacción con la fase estacionaria. El flujo puede ser por gravedad o aplicando presión con gas inerte/aire.
¿Qué es la Cromatografía flash?
Cuando se emplea presión para impulsar el eluyente, se denomina cromatografía flash. La columna debe tener un ajuste esmerilado[1] en la parte superior para acoplar un adaptador con salida lateral (oliva) y conectar el suministro de gas.
La flash es más rápida y eficiente que por gravedad porque usa partículas más finas de sílice/alúmina (p. ej., 40–75 µm), aumentando el recorrido efectivo y mejorando la separación a mayores caudales.
Procedimiento para realizar una CC flash con gel de sílice
Elección de la fase móvil
Selecciona el eluyente con ayuda de CCF previa (sobre sílice) buscando Rf ~0,3–0,5 y buena resolución entre manchas. Un eluyente muy polar eluye rápido (poca separación); muy apolar retiene demasiado.
Fase estacionaria
La cantidad de sílice depende de la masa de muestra y de los Rf en CCF. Orientativo para mezcla con dos manchas separadas y Rf≈0,5: ~50:1 (masa sílice : masa muestra) usando sílice 40–75 µm.
Fija la columna con pinza; prepara una papilla de sílice con el mismo eluyente y empaqueta (wet packing) con embudo de sólidos. Si no hay placa porosa, coloca algodón compacto en el fondo. Limpia el esmerilado de restos y añade una capa de arena (tope) sobre la sílice para evitar levantar el lecho al cargar el eluyente. Deja volumen libre suficiente arriba para añadir el disolvente.
Aplicación de la muestra
Si es soluble en el eluyente: disuélvela en mínimo volumen y deposítala con gotero justo sobre la sílice, sin manchar paredes.
Si es insoluble: prepara una disolución en un solvente volátil, añade sílice, evapora a presión reducida en rotavapor con rompe-espumas (bola de Kjeldahl) (o una espátula dentro para evitar “salto” de sílice). Introduce la sílice con el producto adsorbido en la parte superior de la columna.
Adición del eluyente
Añade el eluyente, coloca el adaptador con salida lateral y conecta el tubo flexible al gas/bomba. Asegura con clip. Se puede intercalar un depósito adicional de solvente entre columna y toma de presión.
Velocidad de elución
Existe un caudal óptimo. Si es lento, aumenta la difusión longitudinal (band broadening) y baja la eficiencia; si es rápido, la muestra no interacciona suficiente con el lecho y la separación empeora. En columnas estrechas, usa caudal más bajo que en columnas anchas.
Recogida del eluyente y aislamiento de los productos
Recoge por fracciones en tubos de ensayo ordenados en gradilla. Analiza por CCF qué fracciones contienen producto(s), combina las válidas en matraz de fondo redondo y evapora el solvente (rotavapor).
Consejos rápidos:
- Desgasifica el eluyente (ultrasonidos o vacío) para columnas largas.
- Evita secar el lecho: mantén siempre cubierta la sílice.
- No sobrecargues: como guía, ancho de banda ≤ 1/10 del diámetro de la columna.
- Usa gradiente de polaridad si la mezcla es amplia (hexano → hexano/AcOEt).
Referencias y notas
- [1] Fija la unión esmerilada con pinza Keck o clip metálico.
- Isac-García, J.; Dobado, J. A.; Calvo-Flores, F. G.; Martínez-García, H. (2015).
Experimental Organic Chemistry Laboratory Manual.
Elsevier Science & Technology. ISBN: 978-0-12-803893-2.
Catedrático de Química Orgánica en la Universidad de Granada, con una larga trayectoria en Química Computacional, en modelado y diseño molecular.