Cromatografía en columna (CC)

La cromatografía en columna (CC) es un método que se emplea con frecuencia para la purificación de sustancias y la separación de mezclas o a escala preparativa. Usa como dispositivo principal, una columna de cromatografía. La columna se rellena con un adsorbente que actúa como fase estacionaria, generalmente, gel de sílice o alúmina.

Se introduce la muestra en la columna y el paso de un disolvente o mezcla de disolventes (eluyente) hace que se separen las impurezas del producto deseado o que se separen los componentes de una mezcla, debido al diferente tiempo de retención sobre la fase estacionaria. El paso del eluyente que recorre la columna puede hacerse bien por efecto de la gravedad, o ejerciendo presión con un gas inerte o aire mediante una bomba.

Cromatografía flash

Cuando se utiliza la ayuda de la presión para hacer pasar el eluyente se le denomina “cromatografía flash” o a presión. En este último caso, la columna debe tener un ajuste esmerilado[1] en la parte superior al que se le conecta un adaptador con un tubo lateral con oliva al que se le une un tubo flexible por el que se le suministra el gas a presión.

La cromatografía “flash” es muy eficiente y presenta la ventaja de ser mucho más rápida que la cromatografía por gravedad. La fase estacionaria que se emplea en esta técnica es específica para la misma, ya que tiene un tamaño de partícula inferior que la cromatografía convencional.

Eso se debe a que partículas más finas de absorbente suponen un camino efectivo más largo para el eluyente, lo cual es beneficioso cuanto mayor sea la velocidad de flujo de la fase móvil, como ocurre en la cromatografía “flash“.

Procedimiento para realizar una CC flash con gel de sílice

Procedimiento para realizar una CC flash con gel de sílice

Elección de la fase móvil

La elección del disolvente es crucial para una buena separación. Si el disolvente que se va a usar es muy polar, la elución será rápida y habrá poca separación entre el producto y las impurezas o entre los componentes de la mezcla.

Si por el contrario el disolvente es muy apolar, los compuestos quedarán retenidos en la columna. Por ello, se deben desarrollar varias placas CCF con gel de sílice para determinar cuál es el disolvente o combinación de disolventes más adecuado para que las manchas que se observan estén lo más separadas posibles.

Fase estacionaria

La cantidad de gel de sílice que se emplee depende de la cantidad de muestra que se quiera purificar y del Rf que presenten las manchas en la CCF.

A título orientativo, para una muestra con un par de manchas, Rf  en torno a 0.5 y que la CCF muestre una separación entre ellas apreciable, la cantidad de gel de sílice (del tipo 40-75 μm) por unidad de masa de muestra sería aproximadamente 50:1.

Se fija la columna con una pinza a un soporte y se introduce la fase estacionaria formando una papilla con el mismo eluyente que se va a usar después con ayuda de un embudo de sólidos. Si la columna tiene en la base una placa de vidrio poroso se puede añadir directamente, en caso contrario se coloca una bola de algodón con ayuda de una varilla de vidrio compactado para que retenga la gel de sílice en la columna y deje pasar al eluyente.

Por tanto, es importante que no se ensucie el ajuste esmerilado de la columna con la gel de sílice, para lo cual se debe arrastrar con disolvente los restos que puedan haber. Se puede poner un poco de arena en el límite del gel de sílice para evitar que se remueva cuando se añade el eluyente.
El tamaño de la columna debe ser lo suficientemente grande como para dejar un volumen libre que permita añadir el eluyente.

Aplicación de la muestra

Por lo general, se introduce la muestra en la columna ajustando el nivel del eluyente justo al límite del gel de sílice. Si la muestra es soluble en el eluyente, se disuelve este en la mínima cantidad posible del mismo y se trasvasa a la columna con un gotero, sobre la gel de sílice, evitando manchar las paredes de la columna.

En caso de que sea insoluble, en un matraz de fondo redondo se prepara una disolución de la muestra a la que se añade gel de sílice. Se evapora el disolvente a presión reducida en un rotavapor intercalando entre el tubo guía y el matraz un rompe-espumas para evitar que la gel de sílice salte del matraz al tubo guía.

Un efecto análogo al rompe-espumas se puede conseguir si se introduce en el matraz una espátula, teniendo la precaución de que no impida el giro del matraz.

Una vez evaporado el disolvente se introduce el gel de sílice con el producto adsorbido en la superficie de esta en la columna.

Adición del eluyente

Una vez que la muestra se ha introducido en el soporte, se añade el eluyente, se coloca un adaptador con una salida lateral conectada al equipo de presión o la bomba con un tubo flexible. Se asegura con un clip y se aplica la presión. Se puede usar un depósito adicional para el disolvente, intercalándolo entre la columna y la toma de presión.

Velocidad de elución

Para cada separación cromatográfica hay un valor óptimo de velocidad de elución. Si la velocidad con la que fluye el eluyente es demasiado lenta, la muestra difunde excesivamente dentro de la columna, el tiempo de ejecución de la separación se alarga y disminuye la eficiencia de la separación.

velocidad de elucion en cromatografia en columna CC

Si por el contrario el flujo de eluyente es demasiado rápido, no da tiempo para que la muestra interaccione con el relleno de la columna y la separación no es eficiente.

Por otro lado, para lograr una separación eficiente en las columnas de diámetro pequeño, el flujo de eluyente debe ser mucho más lento que en las de mayor grande.

Recogida del eluyente y aislamiento de los productos

Lo usual es recoger el eluyente en tubos de ensayo, que deberán colocarse de forma ordenada en una gradilla. Para saber en qué fracciones está el producto o productos que se han purificado, se hace un análisis de estas por CCF.

Una vez sabido en qué fracciones se encuentran los productos, se reúnen las correspondientes fracciones en un matraz de fondo redondo y se elimina el disolvente (rotavapor).

Referencias y notas

[1] No olvidar fijar la unión esmerilada con una pinza Keck o “clip” metálico.